一套完整的MLPA检测由通用试剂盒与应用特异性的探针混合物共同完成。了解MLPA试剂盒的组分、规格与储存要求,有助于实验人员正确选择和保存试剂,保证检测结果稳定可重复。
以SALSA MLPA通用试剂盒为例,按反应数分为EK1(100反应)、EK5(500反应)和EK20(2000反应)三种规格,PCR引物带FAM或Cy5荧光标记,可依据实验通量与毛细管电泳仪的染料类型选择。试剂盒包含六个组分:MLPA缓冲液(黄盖)、连接酶Ligase-65(绿盖)、连接酶缓冲液A(透明盖,含辅酶NAD)、连接酶缓冲液B(白盖)、PCR引物混合物(棕盖,含荧光标记寡核苷酸与dNTPs)以及聚合酶(橙盖)。针对具体检测目标,还需搭配对应的MLPA探针混合物(黑盖),部分产品附带参考DNA或特殊样品DNA(蓝盖)。
储存方面,所有组分到货后必须立即存放于-25℃至-15℃之间,避光并保留在原包装中,有效期以各瓶标签为准;产品冻融周期不应超过25次。探针、连接酶及缓冲液A等关键组分建议分装保存,避免反复冻融影响性能。
除试剂盒本身外,MLPA实验还需自备超纯水、TE缓冲液、带加热盖的校准热循环仪(99-105℃)、毛细管电泳仪及片段分析软件、高品质甲酰胺、荧光标记尺寸标准品、聚合物,以及官方免费的Coffalyser.Net分析软件。质控方面,绝大多数MLPA探针混合物内置九个质控片段:Q片段(64、70、76、82 nt)用于判断DNA用量是否充足及连接是否成功;D片段(88、96 nt)用于判断样本DNA变性是否充分;X、Y片段(100、105 nt)用于监控样本混淆。分析时应逐一核查,确保数据质量达标后再作结论。
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